432

PAKKMBTN

Kompetensi

Teknik Prediksi Risiko & Pengendalian Dampak Radiasi
Pengendalian Penyakit Menular & Aplikasi Kedokteran Nuklir
Deteksi Penyebab Penyakit Malagizi dan Gangguan Kesehatan Akibat Pencemaran Lingkungan
Biomaterial dan Bahan Pangan Steril untuk Keperluan Klinik

Laboratorium

Lain-Lain

Galeri

 

Link


   




Bookmark and Share

IDENTIFIKASI Mycobacterium tuberculosis DAN Analisis MUTASI
GEN rpoB DAN katG penyebab resistensi GANDA
DENGAN TEKNIK MOLEKULER

Mukh Syaifudin1, Marialina Rosilawati2, Harris Irawan3 dan Budiman Bela4
1Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi,-BATAN, 2Pusat Teknologi Aplikasi Isotop dan Radiasi-BATAN, 3Fakultas MIPA Jurusan Biologi, Universitas Sebelas Maret (UNS), 4Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia.



ABSTRAK

Identifikasi yang akurat terhadap spesies Mycobacterium akan menjamin keberhasilan pengobatan tuberkulosis (TB) yang diakibatkan oleh infeksi Mycobacterium tuberculosis. Di samping itu, resistensi ganda M. tuberculosis (multidrug-resistance, MDR) di Indonesia masih perlu dikaji lebih jauh. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui mekanisme molekuler resistensi M. tuberculosis terhadap rifampin dan isoniazid yakni mutasi gen rpoB dan katG menggunakan teknik nested polymerase chain reaction (PCR)-single strand conformation polymorphism (SSCP) radioaktif pada sputum basil tahan asam (BTA) positif. DNA M. tuberculosis yang diekstrak dengan guanidin tiosianat dan Diatom, diamplifikasi dengan PCR dan sekaligus dilabel dengan [α-32P-dCTP] untuk primer kedua gen tersebut. Perubahan mobilitas produk PCR dideteksi dengan poliakrilamid 7,5%. Hasil analisis menunjukkan bahwa 60 (85,71%) dari 70 ekstrak DNA adalah PCR positif dengan primer MF-MR dari gen rpoB. Lima (7,14%) dan 12 (17,14%) isolat masing-masing memiliki mutasi gen yang diduga menjadi penyebab resisten terhadap rifampisin dan isoniazid, dan hanya 1 (1,42%) isolat yang resisten terhadap kedua obat (MDR-TB). Hasil studi ini mengindikasikan bahwa mekanisme molekuler resistensi ganda isolat M. tuberculosis melibatkan perubahan pada gen rpoB dan katG dimana prosentasenya berbeda dengan penelitian lain. Diagnosa molekuler dengan PCR sangat berguna untuk deteksi dini TB dan SSCP radioaktif dapat diterapkan untuk mendeteksi resistensi namun memerlukan penanganan yang lebih intensif.

Kata kunci : MDR-TB, M. tuberculosis, resisten, rpoB, katG, PCR, SSCP, 32P-dCTP

ABSTRACT

An accurate identification of different species of Mycobacterium provides to allow appropriate treatment for tuberculosis (TB) which was caused by infection of Mycobacterium tuberculosis. Beside that, multi-drug resistance (MDR) of M. tuberculosis strains in Indonesia need to be assessed deeper. The aim of research is to seek for the mechanism of resistance of M. tuberculosis to rifampicin and isoniazid, the mutation of a part of the rpoB and katG genes was analyzed with radioactive nested polymerase chain reaction (PCR)-single strand conformation polymorphism (SSCP) in sputa with positive acid fast bacilli. DNA extracted with guanidin tiosianat was amplified with PCR and labeled using [α-32P-dCTP] for primer of both genes. The alteration of PCR product mobility was detected by 7.5% polyacrylamide gel. Sixty (85.71%) of 70 DNA extracts were PCR positive for MF-MR primer of rpoB gene. Five (7.14%) and 12 (17.14%) isolates had gene mutation that suggested to cause resistant to rifampin and isoniazid, respectively, whereas only 1 (1.42%) isolate was resistant to both drugs (MDR-TB). The results from our study clearly indicate that the molecular mechanism of resistance in M. tuberculosis isolates involves alterations in the rpoB and katG genes where its percentage was different with other research. The authors also conclude that molecular diagnosis by PCR is useful for early detection of TB in sputum specimen and radioactive SSCP could be implemented for the detection of resistance but it needs more intensive handling.

Keywords : MDR-TB, M. tuberculosis, resistant, rpoB, katG, PCR, SSCP, 32P-dCTP


I. PENDAHULUAN

Tuberkulosis (TB) adalah penyebab utama kematian yang disebabkan oleh M. tuberculosis pada kelompok dewasa dan mengkontribusi 26,0% dari seluruh kematian di dunia sehingga harus menjadi prioritas utama yang memerlukan pengobatan tepat dan didukung oleh hasil-hasil penelitian.1 Prevalensi TB di Indonesia diketahui sebesar 0,24% berdasarkan uji usapan sputum positif, dan merupakan 5,6% dari 7,5 juta kasus TB baru di seluruh dunia pada 1990.2,3 Oleh karena itu diperlukan teknik deteksi yang cepat dan spesifik agar dapat dilakukan pengobatan segera. Akan tetapi efektivitas strategi ini terkendala akibat merebaknya TB yang resisten terhadap obat, terutama multidrug-resistance tuberculosis (MDR-TB) yang didefinisikan sebagai resisten paling tidak terhadap isoniazid and rifampisin.4 Pasien MDR-TB memerlukan pengobatan dengan obat lini kedua yang lebih beracun dan lebih tinggi risiko penularannya serta biaya yang lebih mahal karena tinggal di rumah sakit lebih lama.5 MDR-TB muncul sebagai akibat akumulasi mutasi penyebab resistensi pada satu obat atau akuisisi unsur-unsur MDR.6 Sejumlah besar penelitian telah dilakukan untuk mengetahui dasar-dasar genetika resistensi M. tuberculosis yang dapat muncul jika kemoterapi tidak tuntas atau tidak adekuat.7,8

Genus Mycobacterium terdiri lebih dari 70 spesies, dan beberapa diantaranya bersifat patogen terhadap manusia, sehingga identifikasi menjadi sangat penting. Berbagai macam metode berbasis PCR telah digunakan untuk maksud ini seperti PCR-restriction analysis (PRA) pada gen-gen 16S, hsp65 dan dnaJ.9 Suatu metode yang antara lain dikembangkan oleh Kim dkk adalah PCR dupleks berdasarkan variasi gen rpoB antar spesies Mycobacterium sehingga memungkinkan untuk mengidentifikasi secara simultan kompleks M. tuberculosis dan non-tuberculosis mycobacteria (NTM).10 Di samping itu diskriminasi M. tuberculosis dan NTM selama fase awal infeksi sangat diperlukan seiring dengan bertambahnya infeksi oleh NTM dimana cara pengobatan dan kondisi pengkulturannya berbeda. Sebagai contoh infeksi M. avium tercatat pada hampir 50% dari seluruh kasus infeksi akibat mikobakteria diantara pasien AIDS di daerah tertentu.11

Rifampisin (RMP) adalah obat antibakteri yang handal dan merupakan komponen standard resimen kombinasi serta obat lini pertama untuk TB karena aktivitasnya yang tinggi melawan M. tuberculosis. RMP adalah antibiotik semisintetik turunan Streptomyces mediterranei yang bersifat bakteriostatik dan bakterisidal serta paling aktif melawan organisme yang berkembang biak cepat. Analisis pada ±500 strain M. tuberculosis dari berbagai penjuru dunia menemukan bahwa 96% isolat yang resisten RMP memiliki mutasi di segmen 81-bp gen rpoB, suatu house-keeping gene yang mengkode sub-unit-beta dari polimerase RNA 8,9,11 dan mampu mengeblok masuknya nukleotida pertama untuk mengaktifkan polimerase sehingga menghalangi sintesis mRNA. Mutasi ini tidak ditemukan pada organisme yang rentan (susceptible). Sebagian besar mutasi missense penyebab resistensi RMP terjadi pada kodon 513, 526, or 531 dari gen rpoB, dan sebagian kecil pada posisi 514 atau 533.8 Diperkirakan 90% isolat resisten RMP juga resisten terhadap isoniazid, sehingga resistensi terhadap RMP merupakan pertanda penting (surrogate) MDR.12,13

Isoniazid (INH) termasuk obat lini pertama pengobatan TB selama lebih dari 40 tahun dengan cara memblok sintesis asam mikolat dinding sel yang merupakan komponen utama amplop M. tuberculosis. INH saat ini juga direkomendasikan untuk mencegah TB pada kelompok pasien human immunodeficiency virus (HIV) dan anak-anak yang tinggal bersama penderita TB paru.14 Bukti-bukti genetik menunjukkan bahwa mutasi gen-gen katG, inhA, ahpC, oxyR dan kasA merupakan penyebab kekebalan terhadap INH, dengan persentase mutasi pada gen katG sebesar 60-70%, dan selebihnya pada gen lain. Modifikasi KatG, baik sebagian atau delesi total, dan mutasi titik atau insersi menyebabkan penurunan aktivitas katalase dan tingginya resistensi terhadap INH. Katalase ini esensial untuk mengaktifkan INH menjadi derivat hidrazin yang aktif.15 Data dari RS Persahabatan tahun 1993 menunjukkan resistensi M. tuberculosis terhadap INH adalah 7,7% sedangkan hasil penelitian di propinsi DKI, Sumatera Barat dan Sulawesi Selatan berkisar antara 11,9% dan 15,6%.16,17

Pengkajian mekanisme molekuler penyebab resistensi memerlukan pengembangan dan aplikasi beberapa strategi berbasis PCR yang didesain untuk mendeteksi mutasi secara cepat seperti duplex18, multiplex19-20 atau real-time PCR.21 Deteksi genomik dengan PCR terbukti lebih cepat, sederhana, dan sangat sensitif. Makalah ini menyajikan hasil analisis molekuler radioaktif yang sensitif namun memerlukan penanganan yang lebih intensif.


II. BAHAN DAN METODE

II.1. Sampel klinis.
Sebanyak 70 sampel sputum diperoleh dari pasien rawat jalan (55 wanita dan 15 pria; umur rata-rata 67± 15.2) di Perkumpulan Pemberantasan Tuberkulosis Indonesia (PPTI) Pusat, Jl. Sultan Iskandar Muda No. 66A Kebayoran Baru, Jakarta Selatan (50 sampel) dan Balai Pengobatan Penyakit Paru-paru (BP4), Jl. Prof. dr. Suharso 28, Surakarta, Jawa Tengah (20 sampel). Pasien yang diambil sampelnya tidak diketahui status infeksi HIV atau AIDS tetapi diduga menderita TB berdasarkan hasil diagnosis basil tahan asam (BTA) positif dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen pada sputum. Kriteria spesimen ditentukan berdasarkan hasil pewarnaan tersebut, dan jika sampel mengandung >3 basil maka dikategorikan sebagai BTA positif.

II.2. Ekstraksi DNA mikobakteri dari sampel sputum. Isolasi DNA dari spesimen klinis dilakukan dengan prosedur seperti telah ditinjau sebelumnya.22 Lima ratus mikroliter sputum dicampur dengan volume sama larutan pelisis (NaOH, Na-sitrat dan N-acetyl L-cysteine) dalam tabung mikrosentrifus streril dan dikocok dengan horizontal gyrotary shaker selama 20 menit pada 420 rpm. Setelah disentrifus 10 menit pada 12.000 rpm, pelet dicuci dengan akuadest steril dua kali. Ke dalam pelet ditambahkan larutan TE dan larutan pelisis (guanidin tiosianat, Tris-HCl, EDTA dan Triton-X) dan 20 µl Diatom kemudian dikocok kembali selama 10 menit pada 100 rpm dan disentrifus 2 menit. Setelah dicuci dengan buffer dan etanol 70% dingin masing-masing 2 kali dan aseton satu kali, pelet dikeringkan pada 56°C. Pada pelet kering ditambahkan larutan TE dan diinkubasi 56°C selama 10 menit. Setelah disentrifus, supernatannya digunakan untuk template PCR. Seluruh prosedur inokulasi dan ekstraksi DNA dilakukan dalam Biological safety cabinet class II. Konsentrasi ekstrak DNA diukur dengan Nanodrop ND 1000 Spectrophotometer and Analysis Software (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).

II.3. Amplifikasi DNA mikobakteri dengan PCR.
Sepasang primer oligonukleotida digunakan untuk mengamplifikasi fragmen 342 bp yang spesifik untuk kompleks M. tuberculosis yakni MF: 5'-CGA CCA CTT CGG CAA CCG-3'; dan MR: 5'-TCG ATC GGG CAC ATC CGG-3' (Genotech Corporation Korea), yang menyandi daerah Rifr 23 yang berhubungan dengan resistensi RMP. Amplifikasi dilakukan dengan menambahkan template DNA (50 ng) dan 20 pmol masing-masing primer ke dalam tabung PCR AccuPower PCR PreMix; Bioneer, Chungbuk, Korea yang mengandung 1 U of Taq DNA polymerase, 250 µM masing-masing deoxynucleoside triphosphate (dNTP), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, dan gel loading dye, dan volume dijadikan 20 µl dengan akuadest. Kontrol positif adalah DNA dari strain standard M. tuberculosis (H37Rv) dan kontrol negatif adalah akuadest. Siklus amplifikasi dilakukan pada Automated thermal cycler (Bio Rad Gene Cycler, Japan). Profil siklus adalah denaturasi awal 95°C selama 5 menit diikuti 30 siklus terdiri dari denaturasi pada 95°C selama 30 detik, annealing pada 60°C selama 30 detik, dan ekstensi pada 72°C selama 45 detik. Ekstensi akhir dilakukan pada 72°C selama 5 menit.

II.4. Deteksi produk PCR. Produk PCR dielektroforesis pada 1.5% agarose (Sigma Aldrich, Inc. USA) yang dilarutkan dalam 1.0X TAE (Tris-asetat-EDTA) mengandung etidium bromide (0.5 µg/ml) dan divisualisasi pada panjang gelombang 260 nm UV transilluminator (Chromato-Vue San Gabriel CA, USA Model TM36) dilengkapi Foto/Analyst Mini Visionary Fotodyne Inc., Hardland WI, USA Model No. 69 dan Mitsubishi Video copy processor P67UA.

II.5. Identifikasi M. tuberculosis dengan PCR dupleks.
PCR dupleks dilakukan dengan menggunakan primer rpoB yang dipilih dari deret nukleotida spesifik strain M. tuberculosis atau non-tuberculosis micobacterium (NTM) seperti telah ditinjau sebelumnya.23 Primer Tbc1 (5′-CGT ACG GTC GGC GAG CTG ATC CAA-3′)-TbcR5 (5′-C CAC CAG TCG GCG CTT GTG GGT CAA-3′) dan M5 (5′-G GAG CGG ATG ACC ACC CAG GAC GTC-3′)-RM3 (5′-CAG CGG GTT GTT CTG GTC CAT GAA C-3′) mengamplifikasi DNA berukuran 235-bp dari kompleks M. tuberculosis dan DNA 136-bp dari NTM. Primer (Tbc1-TbR5 10 pmol dan M5-RM3 20 pmol) dan 3 μl DNA template ditambahkan ke dalam tabung PCR (AccuPower PCR PreMix; Bioneer, Daejeon, Korea) berisi campuran Taq polymerase 2U, dNTP masing-masing 250 μM, Tris-HCl 10 mM (pH 8.3), dan MgCl2 1,5 mM dan air ditambahkan untuk memperoleh volume akhir 20 μl per campuran reaksi. PCR dilakukan pada mesin Bio Rad Gene Cycler, Japan dengan denaturasi awal pada 95°C selama 5 menit, 30 siklus amplifikasi (30 detik pada 95°C, 30 detik pada 74°C, 4 menit pada 74°C), dan elongasi akhir padat 74°C selama 5 menit. Produk PCR dianalisa dengan elektroforesis pada gel agarose (1,5%).

II. 6. Nested PCR radioaktif.
Nested PCR dilakukan dengan primer outer TB1 (5'-ACG TGG AGG CGA TCA CAC CGC AGA CGT-3') dan TB2 (5'-TGC ACG TCG CGG ACC TCC AGC CCG GCA-3') dan primer inner TB3 (5'-TCG CCG CGA TCA AGG AGT TCT TC-3') dan TR8 (5’-TGC ACG TCG CGG ACC TCC-3’) seperti ditinjau sebelumnya.24 PCR dilakukan dalam tabung premix komersial (AccuPower PCR PreMix; Bioneer) yang mengandung Taq polymerase 2U, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), dan MgCl2 1,5 mM. Primer TB1 dan TB2 masing-masing 20 pmol serta primer TB3 and TB8 masing-masing 1,25 pmol dimasukkan ke dalam premix dan kemudian volume dibuat menjadi 20 µl. Satu mikroliter (0,1 µCi) [-32P]dCTP (Amersham International) ditambahkan ke dalam campuran reaksi serta dilakukan PCR dengan tahapan proses preheating pada 940C selama 5 menit, diikuti amplifikasi awal sebanyak 15 siklus (30 detik pada 94°C, 1 menit pada 82°C), dan dilanjutkan amplifikasi kedua sebanyak 30 siklus (30 detik pada 94°C, 1 menit pada 72°C) serta ekstensi 5 menit pada 72°C. PCR dilakukan pada mesin BioRad Thermalcycler Japan.

II.7. Analisis mutasi gen dengan teknik SSCP radioaktif.
Dalam penelitian ini digunakan metode SSCP untuk melokalisir DNA mutan. Enam mikroliter produk PCR berlabel 32P radioaktif dicampur dengan 2 µl SSCP loading dye dan 4 µl formamide 95% (Biorad) yang mengandung denaturant urea (Biorad). Sampel didenaturasi pada 95°C selama 4 menit dan kemudian diletakkan di atas es serta dielektroforesis pada gel 0.5X Mutation Detection Enhancement (MDE) (BMA, Rockland, ME, USA) pada tegangan 50-51 Volt dan suhu kamar selama 5-7 jam. Gel MDE diambil dengan menempelkan kertas saring Whatman, kemudian ditutup dengan plastik saran wrap dan dikeringkan dengan vakum-panas (Rapid Dry, Atto, Japan) selama 1 jam. Setelah kering, gel diletakkan dalam kaset film dan diatasnya diletakkan film sinar-X (Kodak). Kaset disimpan pada pendingin suhu -80°C selama 24 jam - 3 hari dan film dicetak dengan Fuji Medical Processor 1200 Japan.23



III. HASIL PENELITIAN

III. 1. Identifikasi spesies M. tuberculosis dan NTM.
Dari 70 spesimen yang diduga mengandung M. tuberculosis berdasarkan hasil uji BTA positif, 60 spesimen menunjukkan hasil positif keberadaan M. tuberculosis dengan PCR konvensional untuk primer MF-MR untuk gen rpoB. Dengan PCR dupleks, dari ke-60 spesimen ini, lima spesimen diantaranya mengandung campuran kompleks M. tuberculosis dan NTM. Hasilnya disajikan dalam Gambar 1 yang menunjukkan adanya dua pita DNA dari kompleks M. tuberculosis dan NTM masing-masing berukuran 235 base pair (bp) dan 136 bp pada sampel nomor 28, 30, 58 dan 59 dan 60. Dengan demikian kelima pasien tersebut disarankan menjalani pengobatan khusus. Satu sampel lain (nomor 60) yang juga mengandung NTM tidak diperlihatkan. Hasil ini menunjukkan keandalan teknik PCR yang dapat diterapkan langsung pada spesimen sputum untuk deteksi simultan M. tuberculosis. Sputum pasien dengan hasil BTA positif, TB yang belum diobati dan yang diduga TB resisten adalah kelompok yang paling ideal untuk uji PCR. Penelitian ini mampu menunjukkan bahwa metode PCR dupleks mampu mengamplifikasi 2 produk sekaligus (235 dan 136 bp) dari gen rpoB menggunakan dua set primer yang berbeda dengan satu langkah uji. Dengan sensitivitas dan spesifitas PCR 100%23, metode PCR dupleks secara jelas dapat membedakan keduanya. Analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan direct sequencing amplikon NTM dapat digunakan untuk melengkapi identifikasi spesies.

gambar.......................

Gambar 1. Hasil analisis PCR dupleks yang menunjukkan keberadaan kompleks M. tuberculosis dan NTM pada sampel nomor 28 dan 30 dengan marker100 bp dan kontrol positif (PC) serta kontrol negatif (NC).

III.2. PCR nested untuk amplifikasi DNA.
PCR nested yang telah dilakukan menghasilkan produk berukuran 157 bp dimana pita-pita tunggalnya terlihat jauh lebih baik daripada PCR konvensional (Gambar 2). Hal ini disebabkan karena produk yang diamplifikasi oleh fase PCR pertama (sepasang primer TB1-TB2) adalah DNA rpoB berukuran 205 bp yang kemudian digunakan sebagai template untuk amplifikasi fragmen berukuran lebih kecil (157-bp) pada fase PCR kedua sehingga lebih spesifik. Oleh karena itu adanya mutasi dalam DNA yang teramplifikasi dari semua spesimen dapat dianalisis dengan mudah menggunakan teknik SSCP. Satu sampel menunjukkan pita yang memoles sepanjang gel yang mungkin disebabkan karena kontaminasi. Dengan PCR konvensional, ditemukan beberapa pita non spesifik pada hampir seluruh sampel sehingga akan menyebabkan kesulitan untuk analisis dengan SSCP (data tidak disajikan).

gambar............................

Gambar 2. Hasil analisis dengan PCR nested terhadap ekstrak DNA dengan pita-pita produk DNA berukuran 157 base-pair (bp) untuk setiap sampel. M adalah marker bertingkat 100, 200 dan 300 bp. K+ dan K- masing-masing adalah kontrol positif dan kontrol negatif. Pewarnaan dengan EtBr.

III.3. Analisis mutasi gen rpoB dengan SSCP radioaktif.
Dalam penelitian ini 5 (7,1%) dari 70 sampel yang diuji diduga mengandung mutasi gen rpoB penyebab resistensi RMP. Hasil analisis dengan SSCP radioaktif yang menunjukkan kemiripan mobilitas pita DNA dibanding kontrol positif ditunjukkan dalam Gambar 3. Dalam penelitian ini digunakan kontrol positif DNA strain M. tuberculosis yang resisten (R) terhadap rifampisin yakni memiliki mutasi titik gen rpoB pada posisi kodon 526 (CAC→TAC) yang menyebabkan perubahan asam amino histidin (His) menjadi tirosin (Tyr). Sedangkan kontrol yang rentan (susceptible) (S) adalah strain M. tuberculosis yang sensitif terhadap obat karena tidak memiliki mutasi pada gen rpoB. Dari seluruh sampel yang dianalisis, sampel nomor 28, 42, 63, 64 dan 67 diduga mengandung mikobakterium resisten terhadap rifampisin. Namun hal ini perlu dianalisis lebih lanjut dengan sekuensing untuk memastikan jenis mutasinya. Di samping itu perlu dikemukakan bahwa sampel yang positif tersebut belum tentu tidak memiliki mutasi gen rpoB pada kodon lain, karena kontrol positif yang digunakan hanya menunjukkan mutasi pada kodon 526 yang mungkin ukuran produk PCR-nya sama.

gambar................

Gambar 3. Hasil analisis SSCP radioaktif untuk gen rpoB yang menunjukkan resistensi ter- hadap RIF pada sampel nomor 28, 42, 63, 64 dan 67. S adalah sampel standard untuk rentan (susceptible) dan R adalah resisten. Waktu elektroforesis 8 jam pada suhu kamar dan pemajanan 40,5 jam.

III.4. Analisis mutasi gen katG dengan SSCP radioaktif.
Dalam penelitian ini, 12 (7,1%) dari 70 sampel yang diuji diduga mengandung mutasi gen katG penyebab resistensi INH berdasarkan pengamatan mobilitas pita DNA sampel dibanding kontrol. Salah satu hasil analisis SSCP radioaktif yang menunjukkan kemiripan mobilitas tersebut ditunjukkan dalam Gambar 4. Disebabkan karena sesuatu hal seperti homogenitas gel, mobilitas pita sedikit bergelombang namun tidak mempersulit dalam menginterpretasi. Pita-pita DNA sampel dan kontrol yang terlihat tebal disebabkan karena konsentrasinya tinggi atau waktu pemajanan yang terlalu lama sehingga diperlukan teknik tersendiri untuk mengatasi hal ini dan diperoleh pita yang baik dan tajam.

gambar......................

Gambar 4. Hasil analisis SSCP radioaktif untuk gen katG yang menunjukkan resistensi ter- hadap RIF pada sampel nomor 35, 47 dan 52. PC adalah kontrol positif DNA dari strain dengan mutasi pada kodon 423. Waktu elektroforesis 8 jam pada suhu kamar dan pemajanan pada -80oC selama 40,5 jam.


IV. PEMBAHASAN
TB saat ini menyebabkan kematian tertinggi diantara penyakit infeksi dan merupakan pembunuh utama kelompok usia produktif. TB kembali merebak di awal tahun 1990 yang sebelumnya telah dapat dikontrol dengan menerapkan strategi DOTS yang diadopsi dari WHO oleh Program Gerakan Nasional TB (Gerdunas TB) dimana 98% populasi telah dapat dijangkau pada tahun 2001.25 Risiko dari penyakit ini mencapai puncaknya ketika krisis ekonomi tahun 1998 terutama untuk keluarga miskin, pecandu obat dan pengidap HIV. Sesuai dengan Fourth Global Report on TB Control (WHO Report 2000), keberhasilan pengobatan di Indonesia mencapai 54,5% dan laju penemuan kasus tahun 1997 menurun drastis dari 94,3% di tahun 1994, namun demikian terjadi perbaikan dalam hal deteksi kasus, penurunan insiden TB dan penyelesaian masalah khusus seperti MDR-TB berdasarkan hasil-hasil penelitian.

Dalam penelitian ini, telah dikembangkan teknik molekuler berbasis nuklir untuk uji resistensi M. tuberculosis. Resistensi obat ini dapat disebabkan oleh ketidak patuhan pasien untuk mengikuti petunjuk pengobatan yang justru dapat menyebabkan efek samping obat TB itu sendiri.26 Fungsi sistem kekebalan tubuh sangat berhubungan dengan status nutrisi dimana nutrisi yang tidak baik akan mempengaruhi penyerapan obat dan menyebabkan tingkat obat serum sub-terapi yang mengaarah ke non responsif.27 Resistensi obat primer dan acquired juga dapat disebabkan oleh pengobatan yang tidak adekuat, obatnya sub-standard, tidak sesuai atau "mono therapy" (terapi satu obat). Proses biologik alamiah menyebabkan daya tahan mikroba melakukan upaya resistensi yang dapat ditransmisikan secara genetik ketika diobati dengan suatu antimikroba atau penolakan (ekspulsi) fisik obat tersebut.

Frekuensi strain M. tuberculosis yang resisten terhadap RMP diperkirakan terus bertambah. Oleh karena itu diagnosa yang cepat dan akurat serta pengobatan TB yang efektif sangat diperlukan. Teknik amplifikasi gen untuk diagnosa M. tuberculosis dalam spesimen saluran nafas seperti sputum, ditunjang dengan metode kultur dan usapan BTA telah menjadi perhatian serius para peneliti di negara-negara berkembang seperti Indonesia termasuk peneliti di BATAN yang mencoba mengimplemetasikan teknik nuklir untuk pengendalian penyakit infeksi dengan harapan hasilnya lebih sensitif yang terbukti dalam penelitian ini (data tidak disajikan).

PCR digunakan secara meluas dalam laboratorium klinis untuk mendiagnosa TB pulmonari, ekstra-pulmonari, dan diseminasinya. Berbagai macam pasangan primer telah berhasil digunakan dan beberapa diantaranya dicoba dalam penelitian ini dan penelitian lainnya.21 Uji PCR dapat digunakan untuk mengidentifikasi secara cepat patogen melalui amplifikasi selektif daerah yang spesifik spesies dan strain dari genom bakteri.28 Isolasi DNA template dari sputum yang bebas dari semua penghambat adalah komponen esensial dalam uji PCR dan metodenya harus cepat, sederhana dengan proses lisis sel yang baik seperti metode Boom. Namun teknik PCR ini belum merupakan prosedur standard di laboratorium untuk diagnosa TB. Perlu ditegaskan disini bahwa analisis PCR sebaiknya ditunjang dengan DNA sequencing terhadap gen-gen sasaran yang relevan untuk uji MDR-TB. Data hubungan antara fenotip, respon klinis, dan jenis serta posisi mutasi akan menjamin tindakan cepat yang diperlukan untuk membatasi meluasnya transmisi dan infeksi MDR-TB.

Dalam penelitian ini diketahui 5 atau 7,14% dari 70 sampel yang diuji diduga memiliki mutasi penyebab resisten terhadap rifampisin. Frekuensi yang rendah perubahan genetik pada gen rpoB yang berhubungan dengan resistensi in-vitro terhadap RMP dan rifabutin juga ditemukan oleh peneliti lain.29-31 Namun demikian implikasi klinis kegunaan diagnostik deteksi ini masih menemui kontroversi. Hasil penelitian ini menunjukkan hubungan antara mutasi pada segmen pendek gen rpoB dan fenotipik resistensi rifampisin pada lima sampel isolat M. tuberculosis. Meskipun belum diketahui mekanisme lain dalam konteks peranan mutasi rpoB penyebab resistensi rifampisin pada mycobacteria lain, data penelitian ini membuktikan secara mendasar resistensi M. tuberculosis. Hasil ini juga dapat memberikan informasi yang cepat tentang resistensi terhadap rifampisin pada M. kansasii dan M. tuberculosis.32

Frekuensi mutasi D516V (GAC→GTC) pada gen rpoB kodon 531 ternyata berbeda-beda tergantung pada letak geografis. Frekuensi mutasi ini mencapai 37,9% pada isolat dari Hungaria dan sekitar 13,3% pada isolat dari Asia bahkan sangat rendah seperti hasil penelitian oleh Fan dkk dari Cina yakni hanya 2,4%.33 Penelitian ini telah mengidentifikasi 5 isolat resisten terhadap rifampisin yang diakibatkan oleh mutasi pada kodon 531. Mutasi ini adalah mutasi yang paling banyak ditemukan dalam isolat klinis M. tuberculosis dan M. leprae yang resisten terhadap rifampisin serta pada mutan yang diseleksi secara in vitro dari M. tuberculosis 34 dan didukung oleh penelitian Kook dkk pada isolat Korea.18,20 Mutasi pada kodon 531 ini juga ditemukan pada sampel dari negara Asia lainnya yakni dari Jepang.31

Mutasi yang paling sering ditemukan adalah pada Ser-531-Leu, Asp-516-Val, dan His-526-Tyr seperti penelitian Suzuki dkk.35 yang menganalisa isolat dari pasien TB Jepang dan penelitian lain. Hasil dengan frekuensi rendah ini dapat mengimplikasikan mutasi gen rpoB di daerah lain atau adanya paling tidak satu gen lain yang berpartisipasi dalam resistensi rifampisin. Selain mutasi pada kodon 531, ternyata mutasi gen rpoB juga ditemukan oleh Maeda dkk pada kodon 526 (Hys526Tyr) pada 5 dari 30 sampel Indonesia.36 Satu mutasi lain lagi pada kodon 516 (Asp516Asn) juga ditemukan. Mutasi pada kodon 526 juga ditemukan oleh Hirano dkk pada sampel dari Indonesia menggunakan teknik reverse hybridization-based line probe assay (INNO-LiPA Rif TB).37

Dalam penelitian ini telah digunakan PCR nested dan dupleks yang sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi DNA M. tuberculosis DNA dalam spesimen sputum yang paling mudah diperoleh dan juga menyajikan teknik untuk mendeteksi suatu mutasi yang dapat memiliki aplikasi potential dan menjanjikan untuk deteksi cepat resistensi M. tuberculosis. Hal ini akan jauh lebih baik jika analisis PCR diikuti dengan DNA sequencing pada gen sasaran MDR-TB untuk mengetahui jenis-jenis mutasinya. Data kumulatif hubungan antara fenotipe, respon klinis, dan jenis serta posisi mutasi dianjurkan untuk mengetahui respon cepat yang dibutuhkan untuk membatasi besar dan parahnya transmisi dan infeksi MDR-TB.38

Frekuensi dan jenis mutasi pada gen katG juga ternyata spesifik karena perbedaan geografi sehingga hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian lain. Mutasi gen katG pada kodon 315 ditemukan pada 64% dari strain yang resisten terhadap INH di Afrika Selatan dan Tengah serta Barat39, tetapi hanya 26,0% di isolat dari Singapura. Mutasi pada gen lain seperti inhA tercatat antara 6,5-21,6% dari isolat yang resisten terhadap INH. 6,40–42

Sebagian besar metode berdasar-PCR hanya mendeteksi adanya mutasi pada gen katG, tetapi tidak menentukan jenisnya seperti dalam penelitian ini. Hal ini membatasi kemampuan untuk memperkirakan tingkat resistensi terhadap isoniazid dan dapat mengarah ke hasil positif- dan negatif-salah (false-positive dan false-negative). Meskipun beberapa teknik molekuler seperti analisis heterodupleks, line probe assay, dan PCR-SSCP digunakan untuk menganalisis mutasi gen, teknik tersebut masih terbatas hanya pada jenis mutasi yang paling banyak. Kelebihan lain dari SSCP adalah bahwa banyak produk PCR yang dapat diketahui jenis-jenis mutasi sekaligus dan merupakan metode yang jauh lebih efisien untuk mengetahui polymorphism dalam lokus inti. Spesimen sputum untuk diagnosis TB atau infeksi mikobakteri lain juga telah dilakukan oleh Moore dkk menggunakan ligase chain reaction (LCR), ditunjang dengan BTA dan kultur tanpa adanya penghambat dalam spesimen.43,44
Jika dibandingkan dengan penelitian lain, maka hasil penelitian ini berbeda dalam prosentase resistensi yang secara sederhana disebabkan oleh perbedaan teknik deteksi dan faktor lain. Penelitian oleh Aditama dkk mendapatkan angka resistensi terhadap INH 7,3% dan RMP 3,1%.45 Sedangkan penelitian oleh Sinaga dkk menunjukkan 13 (26%) isolat resisten terhadap RMP, 4 (8%) isolat resisten INH, dan 3 (6%) isolat adalah MDR-TB.46 Penelitian di Amerika Serikat oleh Bloch dkk. mendapatkan 14,2% resisten terhadap salah satu atau lebih OAT sedangkan penelitian Wahid dkk. di Jakarta mendapatkan 15,92%.47,48 Angka resistensi yang tinggi pada penelitian ini mungkin disebabkan oleh isolat yang diuji berasal dari penderita yang pernah mendapat pengobatan (resistensi sekunder).


V. DAFTAR PUSTAKA
  1. Raviglione M., Sinder D., Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis-morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA 1995; 273:220-6.

  2. Department of Health, Republic of Indonesia. Proposed national health research priorities: the view of National Institute of Health Research and Development (NIHRD). Jakarta, Indonesia. Ministry of Health Republic of Indonesia, 1999.

  3. Karyadi E, Schultink W, Nelwan RHH, Gross R, Amin Z, Dolmans WMV, van der Meer JWM, Hautvast JGAJ, and West CE. Poor Micronutrient Status of Active Pulmonary Tuberculosis Patients in Indonesia. Journal of Nutrition 2000; 130: 2953-8.

  4. Iseman MD and Madsen LA. Drug-resistant tuberculosis. Clin Chest Med. 1992; 10:341-53.

  5. Cohn D, Bustreo F, and Raviglione M. Drug-Resistant Tuberculosis: Review of the Worldwide Situation and the WHO/IUATLD Global Surveillance Project. Clinical Infectious Diseases 1997; 24 (Supplement 1): S121-30.

  6. Ramaswamy S and Musser J. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 Update. Tubercle and Lung Disease 1998; 79(1): 3-29.

  7. Musser J. Antimicrobial Agent Resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 496-514.

  8. Piatek AS, Telenti A, Murray MR, El-Hajj H, Jacobs WR Jr., Kramer FR, and Alland D. Genotypic Analysis of Mycobacterium tuberculosis in Two Distinct Populations Using Molecular Beacons: Implications for Rapid Susceptibility Testing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000; 44(1): 103-10.

  9. Kim BJ, Lee KH, Park BN, Kim SJ, Bai GH, Kim SJ and Kook YH. Differentiation of Mycobacterial species by PCR-restriction analysis of DNA (342 base pairs) of the RNA polymerase gene (rpoB). Journal of Clinical Microbiology 2001; 39(6): 2102-9.

  10. .Mahmoudi A and Iseman M. Pitfalls in the care of patients with tuberculosis: common errors and their association with the acquisition of drug resistance. JAMA 1993; 270:65-8.

  11. Valim A, Rossetti M, Ribeiro M, and Zaha A. Mutations in the rpoB Gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil. Journal of Clinical Microbiology 2000; 38 (8): 3119-22

  12. Yuen L, Leslie D, and Coloe P. Bacteriological and molecular analysis of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Australia. Journal of Clinical Microbiology 1999; 37(12): 3844-50

  13. Watterson S, Wilson S, Yates M, and Drobniewski FA. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 1998; 36(7): 1969-73.

  14. Nolan CM. Isoniazid for latent tuberculosis infection, approaching 40 and reaching its prime. Am. J. Res. Critical Care Med 2003; 168: 412-3.

  15. Gillespie SH. Evolution of drug resistance in Mycobacterial tuberculosis: clinical and molecular perpective. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2002; 46:267-74.

  16. Basri C. Program Nasional Pemberantasan Tuberkulosis, Seminar Nasional ”Quality assurance programme for molecular-based diagnosis of hepatitis C and tuberculosis”, Jakarta, 2003.

  17. Alamsyah B, Epidemiologi genetik serta factor risiko Mycobacterium tuberculosis yang resisten INH dan atau rifampisin, Desertasi Program Doktor Ilmu Kesehatan Masyarakat, Program Pascasarjana, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Indonesia, 2003.

  18. Kim BJ, Hong SK, Lee KH, Yun YJ, Kim EC, Park YG, Bai GH, and Kook YH. Differential identification of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous Mycobacteria by duplex PCR assay using the RNA polymerase gene (rpoB), Journal of Clinical Microbiology 2004; 42(3): 1308-12.

  19. Herrera-Leon L, Molina T, Saiz P, Saez-Nieto JA, and Jimenez MS. New multiplex PCR for rapid detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2005; 49(1):144-7.

  20. Ko KS, Kim JM, Kim JW, Jung BY, Kim W, Kim IJ, and Kook YH. Identification of Bacillus anthracis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology 2003; 41(7):2908-14.

  21. Drosten C, Panning M and Kramme S. Detection of Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR using Pan-Mycobacterial primers and a pair of fluorescence resonance energy transfer probes specific for the M. tuberculosis complex. Clinical Chemistry 2003; 49: 1659-61.

  22. Garcia L, Alonso-Sanz M, Rebollo MJ, Tercero JC, and Chaves F. Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Spain and their rapid detection by PCR-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology 2001; 39(5): 1813-8.

  23. Kim BJ, Lee KH, Park BN, Kim SJ, Park EM, Park YG, Bai GH, Kim SJ, and Kook YH. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputa by nested PCR-linked single-strand conformation polymorphism and DNA sequencing. Journal of Clinical Microbiology 2001; 39: 2610-7.

  24. Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Schmidheini T, and Bodmer T. Direct, automated detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993; 37: 2054-8.

  25. World Health Organizations. PPM DOTS in Indonesia; A strategy for action. Geneva, Switzerland. 2003.

  26. Kirschner P, Springer B, Vogel U, Meier A, Wrede A, Kiekenbeck M, Bange FC, and Bottger EC. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination: report of a 2-year experience in a clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology 1993; 31: 2882-9.

  27. Farmer P. Immodest claims of causality In: Infections and Inequalites: The Modern Plagues. University of California Press: Berkeley, CA; pp. 231-61, 1999.

  28. Rouse DA, Li ZM, Bai GH, and Morris SL. Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1995; 39: 2472–7.

  29. Bodmer T, Zurcher G, Imboden P and Telenti A. Mutation position and type of substitution in the ß-subunit of the RNA polymerase influence in-vitro activity of rifamycins in rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1995; 35, 345–8.

  30. Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Lowrie D, Cole S, Colston MJ, Matter L, Schopfer K, and Bodmer T. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet 1993; 341: 647–50.

  31. Ohno H, Koga H, Kohno S, Tashiro T and Hara K. Relationship between rifampin MIC for rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1996; 40: 1053–6.

  32. Kim BJ, Lee SH, Lyu MA, Kim SJ, Bai GH, Kim SJ, Chae GT, Kim EC, Cha CY, and Kook YH. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). Journal of Clinical Microbiology 1999; 37: 1714–20.

  33. Fan XY, Hu ZY, Xu FH, Yan ZQ, Guo SQ, and Li ZM. Rapid Detection of rpoB Gene Mutations in Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates in Shanghai by Using the Amplification Refractory Mutation System. Journal of Clinical Microbiology 2003; 41(3): 993-7.

  34. Morlock GP, Plikaytis BB, and Crawford JT. Characterization of spontaneous, in vitro-selected, rifampin-resistant mutants of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000; 44: 3298–301.

  35. Suzuki Y, Katsukawa C, Inoue K, Yin Y P, Tasaka H, Ueda N, and Makino M. Mutations in rpoB gene of rifampicin resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis in Japan. J Jpn Assoc Infect Dis 1996; 69:413–9.

  36. Maeda S, Matsuoka M, Nakata N, Kai M, Maeda Y, Hashimoto K, Kimura H, Kobayashi K, and Kashiwabara Y. Multidrug Resistant Mycobacterium leprae from Patients with Leprosy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001; 45(12): 3635–9.

  37. Hirano K, Abe C, and Takahashi M. Mutations in the rpoB Gene of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated Mostly in Asian Countries and Their Rapid Detection by Line Probe Assay. J Clin Microbiol 1999; 37(8): 2663–6.

  38. Chaubert P, Bastita D and Behattar J. An improved method for rapid screening of DNA mutations by nonradioactive single-strand conformation polymorphism procedure. BioTechniques 1993; 15: 586.

  39. Haas W H, Schilke K, Brand J, Amthor B, Weyer K, Fourie P B, Bretzel G, Sticht-Groh V, and Bremer HJ. Molecular analysis of katG gene mutations in strains of Mycobacterium tuberculosis complex from Africa. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:1601–3.

  40. Kelley CL, Rouse DA, and Morris SL. Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 1997; 41:2057–8.

  41. Morris S, Bai GH, Suffys P, Portillo-Gomez L, Fairchok M, and Rouse D. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Infectious Diseases 1995; 171:954–60.

  42. Musser JM, Kapur V, Williams DL, Kreiswirth BN, van Soolingen D, and van Embden JDA. Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing: restricted array of mutations associated with drug resistance. Journal of Infectious Diseases 1996; 173: 196–202.

  43. Jenkins FJ. Basic methods for the detection of PCR products. PCR Methods and Applications 1994; 3: S77-82.

  44. Moore DF and Curry JI. Detection and Identification of Mycobacterium tuberculosis Directly from Sputum Sediments by Ligase Chain Reaction. J Clin Microbiol. 1998; 36(4): 1028–31.

  45. Aditama TY dan Wijanarko P. Resistensi primer dan sekunder Mycobacterium tuberculosis di RSU Persahabatan Tahun 1994. J Respi Indo 1996; 16: 12-4.

  46. Sinaga H, Sjahid I, Siahaarv N, dan Santoso IP. Resistensi M. tuberculosis terhadap Obat Anti Tuberkulosis Bahan Baku dan Obat Generik di Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran/RSUP Dr. Hasan Sadikin Bandung. Cermin Dunia Kedokteran 2000; 127: 49-53.

  47. Bloch AB, Cauthen GM, and Onorato IM. Nationwide survey of drug resistant tuberculosis in the United States. JAMA 1994; 271: 665-71.
  48. Wahid MH, Harun BMH, dan Kiranasari A. Pemeriksaan mikrobiologik dan pola resistensi Mycobacterium tuberculosis di bagian Mikrobiologi FK UI selama tahun 1995. Majalah Kedokteran Indonesia 1996; 47: 624-7.

Last Modified : 11 January 2009. 05:23:36